Protini K mNGS (kioevu)
Proteinase K ni protini thabiti ya serine na umaalum mpana wa substrate.Inaharibu protini nyingi katika hali ya asili hata mbele ya sabuni.Ushahidi kutoka kwa tafiti za fuwele na muundo wa molekuli unaonyesha kuwa kimeng'enya ni cha familia ya subtilisin iliyo na sehemu tatu ya kichocheo cha tovuti (Asp.39-Yake69-Ser224)Eneo kuu la kupasuka ni kifungo cha peptidi kilicho karibu na kikundi cha kaboksili cha asidi ya amino ya alifati na yenye kunukia yenye vikundi vya alpha amino vilivyozuiwa.Ni kawaida kutumika kwa maalum yake pana.Protease K hii imeundwa mahususi kwa ajili ya mNGS.Ikilinganishwa na protiniase K nyingine, ina uchafuzi mdogo wa asidi ya nukleiki na utendakazi sawa wa kienzymatiki, ambayo inaweza kuhakikisha vyema utumizi wa mNGS ya chini.
Masharti ya Uhifadhi
2-8℃ kwa miaka 2
Vipimo
| Mwonekano | Kioevu kisicho na rangi hadi hudhurungi |
| Shughuli | ≥800 U/ml |
| Mkusanyiko wa protini | ≥20 mg/ml |
| Nickase | Hakuna iliyotambuliwa |
| DNase | Hakuna iliyotambuliwa |
| RNase | Hakuna iliyotambuliwa |
Mali
| Nambari ya EC | 3.4.21.64(Recombinant kutoka kwa albamu ya Tritirachium) |
| Pointi ya Isoelectric | 7.81 |
| pH bora zaidi | 7.0- 12.0 Kielelezo 1 |
| Joto bora zaidi | 65 ℃ Kielelezo 2 |
| utulivu wa pH | pH 4.5- 12.5 (25 ℃, 16 h) Mtini. 3 |
| Utulivu wa joto | Chini ya 50 ℃ (pH 8.0, dakika 30) Mchoro 4 |
| Utulivu wa uhifadhi | Zaidi ya 90% ya shughuli kwa miezi 12 kwa 25 ℃ |
| Vianzishaji | SDS, urea |
| Vizuizi | Diisopropyl fluorophosphate;phenylmethylsulfonyl fluoride |
Maombi
1. Seti ya uchunguzi wa maumbile
2. Vifaa vya uchimbaji wa RNA na DNA
3. Uchimbaji wa vipengele visivyo vya protini kutoka kwa tishu, uharibifu wa uchafu wa protini, kama vile DNA.chanjo na maandalizi ya heparini
4. Maandalizi ya DNA ya chromosome kwa electrophoresis ya pulsed
5. Waa wa Magharibi
6. Vitendanishi vya albin ya glycosylated ya enzymatic in vitro utambuzi
Tahadhari
Vaa glavu za kujikinga na miwani unapotumia au kupima uzani, na uweke hewa ya kutosha baada ya kutumia.Bidhaa hii inaweza kusababisha athari ya mzio wa ngozi na kuwasha kwa macho.Ikivutwa, inaweza kusababisha mzio au dalili za pumu au dyspnea.Inaweza kusababisha kuwasha kwa kupumua.
Ufafanuzi wa kitengo
Kitengo kimoja (U) kinafafanuliwa kama kiasi cha kimeng'enya kinachohitajika ili kukamua kasini kutoa 1 μmol.tyrosine kwa dakika chini ya masharti yafuatayo.
Maandalizi ya vitendanishi
Kitendanishi I: 1g ya kasini ya maziwa iliyeyushwa katika 50ml ya 0.1M ya myeyusho wa fosforasi ya sodiamu (pH 8.0), incubated katika 65-70 ℃ maji kwa dakika 15, ikikorogwa na kufutwa, kupozwa na maji, kurekebishwa na hidroksidi ya sodiamu hadi pH 8.0, na kiasi kisichobadilika. 100 ml.
Reagent II: 0.1M trikloroasetiki asidi, 0.2M acetate ya sodiamu, 0.3M asidi asetiki.
Kitendanishi III: 0.4M Na2CO3suluhisho.
Reagent IV: Forint reagent diluted kwa maji safi kwa mara 5.
Kitendanishi V: Kiyeyushaji cha kimeng'enya: 0.1M myeyusho wa fosfeti ya sodiamu (pH 8.0).
Kitendanishi VI: myeyusho wa tyrosine: 0, 0.005, 0.025, 0.05, 0.075, 0.1, 0.25 umol/ml tyrosine iliyoyeyushwa na 0.2M HCl.
Utaratibu
1. 0.5ml ya reajenti I huwashwa kabla ya joto hadi 37℃, ongeza 0.5ml ya myeyusho wa kimeng'enya, changanya vizuri, na uangulie kwenye37℃ kwa dakika 10.
2. Ongeza 1ml ya reagent II ili kukomesha majibu, changanya vizuri, na endelea incubation kwa 30mins.
3. Suluhisho la mmenyuko wa Centrifugate.
4. Chukua dawa isiyo ya asili ya 0.5ml, ongeza 2.5ml reagent III, 0.5ml reagent IV, changanya vizuri na uangulie kwenye 37℃.kwa dakika 30.
5. OD660iliamuliwa kama OD1;kikundi tupu cha kudhibiti: 0.5ml reagent V hutumiwa kuchukua nafasi ya enzymesuluhisho la kuamua OD660kama OD2, ΔOD=OD1-OD2.
6. Mkunjo wa kiwango cha L-tyrosine: 0.5mL myeyusho tofauti wa L-tyrosine, 2.5mL Reagent III, 0.5mL Reagent IV katika 5mL tube centrifuge, incubate katika 37℃ kwa dakika 30, tambua kwa OD660kwa mkusanyiko tofauti wa L-tyrosine, kisha kupata mkunjo wa kawaida Y=kX+b, ambapo Y ni mkusanyiko wa L-tyrosine, X ni OD600.
Hesabu
2: Jumla ya ujazo wa suluhisho la majibu (mL)
0.5: Kiasi cha myeyusho wa kimeng'enya (mL)
0.5: Kiasi cha majibu ya kioevu kinachotumika katika uamuzi wa kromojeni (mL)
10: Muda wa kujibu (dakika)
Df: Dilution nyingi
C: Mkusanyiko wa enzyme (mg/mL)
Marejeleo
1. Wieger U & Hilz H. FEBS Lett.(1972);23:77.
2. Wieger U & Hilz H. Biochem.Wasifu.Res.Jumuiya.(1971);44:513.
3. Hilz, H.na wengine.,Eur.J. Biochem.(1975);56:103–108.
4. Sambrook Jet al., Uunganishaji wa Molekuli: Mwongozo wa Maabara, toleo la 2, Bandari ya Majira ya baridiVyombo vya habari vya maabara, Bandari ya Majira ya baridi (1989).
Takwimu
Mtini.1 Optimum pH
Ufumbuzi wa bafa wa 100mM:pH6.0-8.0, Na-fosfati;pH8.0-9.0, Tris-HCl;pH9.0-12.5, Glycine-NaOH.Kielelezo cha Enzyme:1mg/mL
Mtini.2 Joto bora zaidi
Mwitikio katika 20 mm K-fosfati bafa pH 8.0.Mkusanyiko wa enzyme: 1 mg/mL
Mtini.3 pH Utulivu
25 ℃, matibabu ya saa 16 yenye myeyusho wa bafa wa mm 50: pH 4.5- 5.5, Acetate;pH 6.0-8.0, Na-phosphate;pH 8.0-9.0, Tris-HCl.pH 9.0- 12.5, Glycine-NaOH.Mkusanyiko wa enzyme: 1 mg/mL
Mtini.4 Joto utulivu
Matibabu ya dakika 30 na bafa ya 50 mm Tris-HCl, pH 8.0.Mkusanyiko wa enzyme: 1 mg/mL
Mtini.5 Hifadhi utulivuty at 25℃
