RTL Reverse Transcriptase
RTL reverse transcriptase ni DNA polymerase inayotegemea kiolezo cha RNA ambayo haina shughuli ya exonuclease ya 3'→5' na ina shughuli ya RNase H.Kimeng'enya hiki kinaweza kutumia RNA kama kiolezo ili kuunganisha uzi wa ziada wa DNA, ambayo inaweza kutumika kwa usanisi wa cDNA ya mkondo wa kwanza, haswa kwa RT-LAMP (ukuzaji wa isothermal unaoingiliana na kitanzi).Ikilinganishwa na RTL reverse transcriptase 1.0, unyeti umeboreshwa kwa kiasi kikubwa, uthabiti wa joto una nguvu zaidi, na mmenyuko ifikapo 65°C ni thabiti zaidi.RTL reverse transcriptase (glycerol free) inaweza kutumika kuandaa maandalizi lyophilized, lyophilized RT-LAMP vitendanishi nk.
Ufafanuzi wa Kitengo
Kitengo kimoja hujumuisha nmol 1 ya dTTP katika nyenzo inayoweza kupeanwa na asidi katika dakika 20 kwa 50°C kwa kutumia poly(A)•oligo(dT)25 kama kiolezo cha kwanza.
Vipengele
| Sehemu | HC5008A-01 | HC5008A-02 | HC5008A-03 |
| RTL Reverse Transcriptase (isiyo na Glycerol) (15U/μL) | 0.1 ml | 1 ml | 10 ml |
| 10×HC RTL Buffer | 1.5 ml | 4×1.5 mL | 5×10 ml |
| MgSO4 (100mM) | 1.5 ml | 2×1.5 mL | 3×10 ml |
Hali ya Uhifadhi
Usafiri wa chini ya 0°C na kuhifadhiwa kwa -25°C~-15°C.
Udhibiti wa Ubora
- Shughuli ya Mabaki yaEndonuclease:Mmenyuko wa 50 μL ulio na μg 1 ya λDNA na vitengo 15 vya RTL2.0 vilivyoangaziwa kwa saa 16 saa 37 ℃ huonyesha muundo sawa na udhibiti hasi kwa kutumia gel electrophoresis.
- Shughuli ya Mabaki yaExonuclease:Mmenyuko wa 50 μL ulio na μg 1 ya Hind Ⅲ λDNA iliyoyeyushwa na vitengo 15 vya RTL2.0 vilivyoangaziwa kwa saa 16 saa 37 ℃ huonyesha muundo sawa na udhibiti hasi kwa kutumia elektrophoresis ya gel.
- Shughuli ya Mabaki yaNickase:Mmenyuko wa 50 μL ulio na 1 μg ya pBR322 iliyosombwa sana na vitengo 15 vya RTL2.0 iliyoangaziwa kwa saa 4 kwa 37°C huonyesha muundo sawa na udhibiti hasi kwa kutumia gel electrophoresis.
- Shughuli ya Mabaki yaRNase:Mmenyuko wa 10 μL ulio na 0.48 μg ya MS2 RNA na vitengo 15 vya RTL2.0 vilivyoangaziwa kwa saa 4 kwa 37°C huonyesha muundo sawa na udhibiti hasi kwa kutumia gel electrophoresis.
- E. koli gDNA:Imepimwa naE.colivifaa maalum vya kugundua HCD, vitengo 15 vya RTL2.0 vina chini ya 1E. kolijenomu.
Usanidi wa Majibu
Itifaki ya Mchanganyiko wa cDNA
| Vipengele | Kiasi |
| Kiolezo cha RNA a | hiari |
| Oligo(dT) 18~25(50uM) au Mchanganyiko Nasibu wa Primer(60uM) | 2 μL |
| Mchanganyiko wa dNTP (10mM kila mmoja) | 1 μL |
| Kizuizi cha RNase (40U/uL) | 0.5 μL |
| RTL Reverse Transcriptase 2.0 (15U/uL) | 0.5 μL |
| 10×HC RTL Buffer | 2 μL |
| Maji yasiyo na nyuklia | Hadi 20 μL |
Vidokezo:
1) Kipimo kilichopendekezwa cha Jumla ya RNA ni 1ng ~ 1μg
2) Kipimo kilichopendekezwa cha mRNA kilikuwa 50ng ~ 100ng
Thermo-Baiskeli Masharti ya utaratibu majibu:
| Halijoto (°C) | Wakati |
| 25 °Ca | Dakika 5 |
| 55 °C | Dakika 10b |
| 80 °C | Dakika 10 |
Vidokezo:
1) Ikiwa Mchanganyiko wa Primer Random unatumiwa, hatua ya incubation katika 25°C.
2) Ikiwa mchanganyiko wa primer unatumiwa, hatua ya incubation saa 55 ° C kwa 10 ~ 30mins.
Itifaki ya RT-LAMP
| Vipengele | Kiasi | Umakini wa Mwisho |
| Kiolezo cha RNA | hiari | ≥10 nakala |
| Mchanganyiko wa dNTP (10mM) | 3.5 μL | 1.4 mm |
| Vitambulisho vya FIP/BIP (25×) | 1 μL | 1.6 μM |
| F3/B3 Primers (25×) | 1 μL | 0.2 μM |
| Vitambulisho vya LoopF/LoopB (25×) | 1 μL | 0.4 μM |
| Kizuizi cha RNase (40U/μL) | 0.5 μL | 20 U/Majibu |
| RTL Reverse Transcriptase 2.0 (15U/μL) | 0.5 μL | 7.5 U/Mitikio |
| Bst V2 DNA Polymerase (8U/μL) | 1 μL | 8 U/Majibu |
| MgSO4 (100mM) | 1.5 μL | 6 mm (Jumla 8 mm) |
| 10×HC RTL Buffer (au 10×HC Bst V2 Buffer) | 2.5 μL | 1 × (2mM Mg2+) |
| Maji yasiyo na nyuklia | Hadi 25 μL | - |
Vidokezo:
1) Changanya na vortexing na centrifuge kwa ufupi kukusanya.Incubation ya joto la kila wakati saa 65 ° C kwa saa 1.
2) Vihifadhi viwili vinaweza kuingiliana na vina muundo sawa.
Vidokezo
1.Bidhaa hii itaunda kingo nyeupe ikihifadhiwa kwa -20 °C.Iondoe kutoka -20 ° C na kuiweka kwenye barafu kwa muda wa dakika 10.Baada ya kuyeyuka, inaweza kutumika kwa kutetemeka na kuchanganya.
2.Bidhaa ya cDNA inaweza kuhifadhiwa kwa -20°C au -80°C au kutumika mara moja kwa athari ya PCR.
3.Ili kuzuia uchafuzi wa RNase, tafadhali weka eneo la majaribio katika hali ya usafi, na vaa glavu na vinyago safi wakati wa operesheni.
