Panda moja kwa moja PCR Kit

Nambari ya Paka: HCR2020A

Plant Direct PCR Kit inafaa kwa ukuzaji wa moja kwa moja wa majani ya mimea, mbegu, n.k., na inaweza kutumika kwa uchunguzi wa juu wa sampuli za mimea ambazo hazina polisakaridi na poliphenoli.Polimasi ya DNA ya ukuzaji wa moja kwa moja kulingana na mageuzi iliyoelekezwa ina ustahimilivu wa hali ya juu kwa vizuizi vya PCR kwenye mimea.Wakati huo huo, hudumisha utendaji wa juu wa ukuzaji, ambao unafaa kwa ukuzaji wa vipande vya DNA ndani ya 5 kb.Bafa ya kipekee ya Lysis A kwenye kifurushi inaweza kutumika kulainisha tishu za mimea mbichi au zilizoganda.Ni rahisi kufanya kazi na lysate inaweza kutumika kama kiolezo cha ukuzaji bila utakaso.Mfumo una mawakala wa kinga ambayo huwezesha sampuli ghafi kuimarishwa kwa ufanisi baada ya kufungia mara kwa mara na kuyeyusha.2 × Plant Direct Master Mix inahitaji tu kuongeza vianzio na violezo ili kutekeleza mwitikio wa ukuzaji, na hivyo kupunguza utendakazi wa bomba na kuboresha ugunduzi na uwezaji wa matokeo.

Vipengele

*Plant Direct Lysis Buffer B ni kitendanishi cha hiari, ambacho hutumika kutenganisha Plant Direct Lysis Buffer A kwa kuongeza muda wa kuhifadhi wa sampuli.Inaweza kutumika kulingana na hali halisi.

Masharti ya Uhifadhi

2 × Panda Mchanganyiko wa Mwalimu wa Moja kwa Moja, hifadhi kwa -30 ~ -15℃ na uepuke kufungia mara kwa mara na kuyeyusha;Panda Direct Lysis Buffer, hifadhi kwa -30 ~ -15℃ au 2 ~ 8℃.

Mchakato wa Majaribio

Uchakataji wa Sampuli-Jani la Kupanda

Mbinu ya moja kwa moja:Inashauriwa kutumia majani madogo.Tumia punch ya shimo na kipenyo cha kudumu cha 0.5 - 3 mm ili kupata sampuli ndogo na sare, na kisha uongeze moja kwa moja sampuli kwenye mfumo wa PCR (mfumo wa 50 μl unapendekezwa).Kumbuka, hakikisha sampuli iko kwenye suluhisho la PCR na sio dhidi ya ukuta wa bomba.Ikiwa PCR ya moja kwa moja inatumiwa kukuza vipande virefu na sampuli changamano, kwa kutumia sampuli yenye kipenyo kidogo (0.5 - 1 mm) kama kiolezo kunaweza kusaidia kupata matokeo bora.

Njia ya kusaga lysis:Inashauriwa kutumia majani madogo.Chukua kipande kidogo cha jani (kipenyo cha 1 - 3 mm), kiweke kwenye 20 μl Panda moja kwa moja Lysis Buffer Ab, na saga iwezekanavyo (hatua hii inaweza kufanywa kwa kufinya jani kwa ncha ya pipette ya 100 μl. kuponda sampuli).Ikiwa kiasi kikubwa cha tishu za majani hutumiwa (usizidi 7 mm), ongeza kiasi cha buffer ya dilution hadi 50 μl.Baada ya majani kuwa chini, suluhisho linapaswa kuonekana kijani.Baada ya kukazia kwa muda mfupi, ongeza μl 1 ya nguvu isiyo ya kawaida kwenye mfumo wa PCR kama kiolezo cha majibu.

Njia ya lysis ya joto:Inashauriwa kutumia majani madogo.Chukua kipande kidogo cha jani (kipenyo cha 1 - 3 mm), kiweke kwenye 20 μl Panda moja kwa moja ya Lysis Buffer A, na upashe moto kwa 95 ° C kwa dakika 5 - 10.Wakati wa lysis unaweza kupanuliwa ipasavyo kwa majani ambayo ni ngumu kusaga (si zaidi ya dakika 20).Ikiwa kiasi kikubwa cha tishu za majani hutumiwa (usizidi 7 mm), ongeza kiasi cha buffer ya dilution hadi 50 μl.Baada ya kupasha joto, weka katikati kwa muda mfupi, na uongeze 1 μl ya nguvu isiyo ya kawaida kwenye mfumo wa PCR kama kiolezo cha majibu.

Uchakataji wa Sampuli- Panda Mbegu

Njia ya kusaga lysis:Tumia kisu ili kukata mbegu zenye kipenyo cha mm 5, ziongeze kwenye 100 μl ya Plant Direct Lysis Buffer A, na saga sampuli kwa ncha ya pipette au zana zingine.Vortex kwa muda mfupi na wacha kusimama kwenye joto la kawaida kwa dakika 3 - 5.Hakikisha sampuli ya mbegu imezama kwenye bafa ya dilution.Baada ya kukazia kwa muda mfupi, ongeza 1 μl ya nguvu isiyo ya kawaida kwenye mfumo wa PCR kama kiolezo cha majibu.

Njia ya lysis ya joto:Tumia scalpel kukata mbegu zenye kipenyo cha mm 5, ziongeze kwenye 100 μl ya Plant Direct Lysis Buffer A, na joto saa 95°C kwa dakika 5 – 10.Wakati wa lysis unaweza kupanuliwa ipasavyo kwa majani ambayo ni ngumu kusaga (si zaidi ya dakika 30).Baada ya kupasha joto, weka katikati kwa muda mfupi, na uongeze 1 μl ya juu zaidi kwenye mfumo wa PCR kama kiolezo cha majibu.

a.Mikasi au zana zingine pia zinaweza kutumika kukata sampuli za saizi inayofaa;ikiwa ngumi au mkasi unatumiwa tena, unapaswa kusafishwa kwa 2% ya mmumunyo wa hipokloriti wa sodiamu kabla ya kila matumizi ili kuzuia uchafuzi wa mtambuka kati ya sampuli.

b.Hakikisha kwamba Bafa ya Mimea ya moja kwa moja ya Lysis imeyeyushwa kikamilifu kabla ya matumizi.Ikiwa bafa ni mnato au ina mvua, inaweza kuwashwa hadi 37℃ ili kuyeyuka kabisa kabla ya matumizi.

c.Kiasi cha kiolezo katika mfumo wa mmenyuko kinaweza kubadilishwa ipasavyo kulingana na tofauti ya ujazo wa nyenzo za mmea na diluent iliyoongezwa.

Panda moja kwa moja Lysis Buffer

Plant Direct Lysis Buffer A iliyo katika bidhaa hii imeboreshwa kikamilifu ili kutoa jenomu ya tishu nyingi za mimea na inafaa kwa uhifadhi wa muda mfupi wa mimea ghafi katika 4℃.Ikiwa sampuli inahitaji kuhifadhiwa kwa muda mrefu zaidi (kwa mfano, miezi 1 - 2), inashauriwa kuhamisha dawa hiyo kwenye bomba mpya la EP na kuihifadhi kwa -20 ℃.Ili kuhifadhi sampuli kwa uthabiti zaidi, ongeza ujazo sawa wa Plant Direct Lysis Buffer B kwenye nguvu kuu iliyohamishwa, changanya vizuri na uhifadhi kwenye -20℃.Muda thabiti wa kuhifadhi hutofautiana kulingana na sampuli za mimea na majimbo.

Mfumo wa Majibu

a.Ina Mg²⁺katika mkusanyiko wa mwisho wa 2 mm.

b.Inashauriwa kutumia mkusanyiko wa mwisho wa 0.4μM kwa kila primer.Matumizi ya ziada ya primers itasababisha kuongezeka kwa amplification isiyo maalum.

c.Kiasi cha sampuli kinachotumiwa kinaweza kubadilishwa kulingana na hali halisi.Kiasi kinachotumiwa katika mmenyuko mmoja wa sampuli ya lysed ghafi kinaweza kubadilishwa kati ya 2% - 20% ya jumla ya kiasi cha majibu.Kutumia sampuli nyingi kunaweza kusababisha kushindwa kwa ukuzaji.

Mpango wa Majibu

a.Ubadilishaji wa Awali (98℃, dak 5) hukuza uchanganuzi wa tishu za mimea, ikitoa DNA ya jeni inayoweza kutumika kwa ukuzaji wa PCR.Usifupishe wakati au kupunguza joto.

b.Inapendekezwa kuiweka sawa na thamani ya primer Tm au 2 ~ 4℃ juu kuliko thamani ya Tm.Ukuzaji wa moja kwa moja wa polimerasi ya DNA inayotumiwa katika bidhaa hii ni tofauti na polimerasi ya Taq DNA ya kawaida, na ina mahitaji maalum ya halijoto ya kupenyeza hewa; matumizi ya halijoto ya juu ya annealing inaweza kwa ufanisi kupunguza upanuzi usio maalum na kuboresha ufanisi wa ukuzaji.Kwa violezo changamano, ukuzaji kwa ufanisi kunaweza kupatikana kwa kurekebisha halijoto ya kuchuja na kuongeza muda wa upanuzi.

c.Ikiwa urefu wa bidhaa ya ukuzaji ni ≤1 kb, muda wa nyongeza umewekwa kuwa 30 sec/kb;ikiwa urefu wa bidhaa ya ukuzaji ni > kb 1, muda wa nyongeza umewekwa kuwa 60 sec/kb.

d.Kwa sampuli changamano au sampuli zenye mavuno kidogo ya ukuzaji, idadi ya mizunguko inaweza kuongezwa ipasavyo hadi mizunguko 40 -50.

Maombi

Inatumika kwa ukuzaji wa moja kwa moja wa tishu za mimea na uchunguzi wa juu wa sampuli za mimea ambazo hazina polysaccharides na polyphenols.

Vidokezo

Kwa matumizi ya utafiti tu.Haitumiwi katika taratibu za uchunguzi.

1. Kwa ukuzaji wa mimea ghafi au ukuzaji wa moja kwa moja, inashauriwa kutumia DNA iliyosafishwa ya genomic kama udhibiti mzuri kabla ya kuanza jaribio ili kuhakikisha kuwa mfumo, vianzio na uendeshaji ni sahihi.

2. Polimasi ya DNA ya ukuzaji wa moja kwa moja inayotumika katika kisanduku hiki ina shughuli kali ya kusahihisha.Ikiwa cloning ya TA inahitaji kufanywa, inashauriwa kutakasa DNA kabla ya kuongeza adenine.

3. Mwongozo wa Kubuni Kwanza:

a.Inapendekezwa kuwa msingi wa mwisho kwenye 3′ mwisho wa kitangulizi kiwe G au C.

b.Kutolingana kwa mfululizo kunapaswa kuepukwa katika besi 8 za mwisho kwenye 3′ mwisho wa kianzio.c.Epuka miundo ya nywele kwenye mwisho wa 3 wa primer.

d.Tofauti katika thamani ya Tm ya kitangulizi cha mbele na kianzilishi cha nyuma haipaswi kuwa zaidi ya 1℃ na thamani ya Tm inapaswa kurekebishwa hadi 60 ~ 72℃ (Primer Premier 5 inapendekezwa ili kukokotoa thamani ya Tm).

e.Mifuatano ya ziada ya kitangulizi ambayo haijalinganishwa na kiolezo, haipaswi kujumuishwa wakati wa kukokotoa thamani ya kitangulizi ya Tm.

f.Inapendekezwa kuwa maudhui ya GC ya primer kuwa 40% -60%.

g.Usambazaji wa jumla wa A, G, C na T katika primer unapaswa kuwa hata iwezekanavyo.Epuka kutumia maeneo yenye maudhui ya juu ya GC au AT.

h.Epuka kuwepo kwa mifuatano inayosaidiana ya besi 5 au zaidi ama ndani ya kianzio au kati ya vianzio viwili na uepuke kuwepo kwa mifuatano inayosaidiana ya besi 3 au zaidi kwenye mwisho wa 3′ wa vianzio viwili.

i.Tumia chaguo za kukokotoa za NCBI BLAST ili kuangalia umaalum wa kitangulizi ili kuzuia ukuzaji usio maalum.