Seti ndogo ya Uchimbaji wa DNA
Seti hii inatumia mfumo ulioboreshwa wa bafa na teknolojia ya utakaso ya safu wima ya jeli ya silika, ambayo inaweza kurejesha vipande vya DNA 70 - 20 kb kutoka viwango mbalimbali vya TAE au gel ya agarose ya TBE.Safu ya utangazaji ya DNA inaweza kutangaza haswa DNA chini ya hali ya chumvi nyingi.Kwa kuongezea, kifurushi kinaweza kusafisha moja kwa moja vipande vya DNA kutoka kwa bidhaa za PCR, mifumo ya athari ya enzymatic au bidhaa ghafi za DNA zilizopatikana kwa njia zingine, na kuondoa uchafu kama vile protini, misombo mingine ya kikaboni, ayoni za chumvi isokaboni na vianzio vya oligonucleotide.Inaweza kuhakikisha kuwa utakaso unaweza kukamilika ndani ya 10-15min.DNA iliyosafishwa inaweza kutumika moja kwa moja kwa kuunganisha, kubadilisha, usagaji wa kimeng'enya, unukuzi wa in vitro, PCR, mpangilio, sindano ndogo, n.k.
Masharti ya kuhifadhi
Hifadhi kwa -15 ~ -25 ℃ na usafirishe kwenye joto la kawaida.
Vipengele
| Vipengele | (Rxns 100) |
| Bafa Pato la Taifa | 80 ml |
| Buffer GW | 2 × 20 ml |
| Bafa ya Elution | 20 ml |
| FastPure DNA Mini Safu-G | 100 |
Bafa Pato la Taifa:DNA inayofunga bafa.
Buffer GW:Kuosha buffer;ongeza ethanoli kabisa kwa kiasi kilichoonyeshwa kwenye chupa kabla ya matumizi.
Bafa ya Elution:Elution.
FastPure DNA Mini Safu-G:Safu wima za matangazo ya DNA.
Mirija ya Mkusanyiko 2 ml:Mkusanyiko wa zilizopo za kuchuja.
Nyenzo Zilizotayarishwa
1.5 ml mirija iliyozaa, ethanoli kabisa na isopropanoli (wakati kipande cha DNA ≤100 bp, ongeza ujazo 1
isopropanol kwa gel ya kiasi 1), umwagaji wa maji.
Mchakato wa Majaribio
Ongeza 80 ml ya ethanoli ili kuondokana na Buffer GW kama inavyoonyeshwa kwenye lebo kabla ya matumizi, hifadhi kwenye joto la kawaida.
Utaratibu
1. Suluhisho la majibu ya PCR
Mpango wa uchimbaji wa jeli:Ongeza kiasi sawa cha mpango wa kurejesha majibu ya Buffer GDP PCR:Ongeza mara 5 ya Bafa ya kiasi
2. Pato la Taifa Kokotoa kiasi cha gel(100 μl sawa na mg 100)
Kufuta gel
3. Washa joto kwa 50 ~ 55℃
4. Funga Osha
Ongeza 300 μL ya Pato la Taifa la Buffer*
Ongeza 700 μL ya Buffer GW
Ongeza 700 μL ya Buffer GW
5. Elute
Ongeza 20 - 30μL ya Elution Buffer au maji yaliyotolewa
Vidokezo* Urejeshaji wa maji ya majibu ya PCR bila hatua hii
Mpango wa uchimbaji wa gel
1. Baada ya electrophoresis ya DNA kwa kugawanya vipande vya DNA, toa mstari mmoja wa kipande cha DNA kutoka kwa gel ya agarose chini ya mwanga wa UV.Inashauriwa kutumia karatasi ya kunyonya ili kunyonya unyevu unaoonekana wa gel na kupunguza ukubwa wa kipande cha gel kwa kuondoa agarose ya ziada iwezekanavyo iwezekanavyo.Pima kipande cha gel (bila bomba la microcentrifuge) ili kuhesabu kiasi chake: Kiasi cha gellice ya 100 mg ni takriban 100 μL, ikizingatiwa kuwa msongamano ni 1g/ml.
2. Ongeza kiasi sawa cha Pato la Taifa la Buffer, weka kwenye 50~55℃ kwa dakika 7-10 (kulingana na ukubwa wa gel, rekebisha muda wa incubation hadi gel itafutwa kabisa).Geuza bomba mara 2 wakati wa incubation.
Δ Kuongeza juzuu 1-3 za Pato la Taifa la Buffer hakutaathiri ufanisi wa kurejesha DNA.Ikiwa kipande cha DNA kitapatikana <100 bp, juzuu 3 za Pato la Taifa la Buffer zinahitaji kuongezwa;wakati kipande cha gel kimepasuka kabisa, ongeza kiasi 1 cha isopropanol na uchanganya vizuri, kisha uendelee hatua inayofuata.
3. Centrifuge kwa muda mfupi kuleta sampuli chini ya bomba, ingiza FastPure DNA Mini Safu-G kwenye Mirija ya Mkusanyiko 2 ml, uhamishe kwa uangalifu myeyusho usiozidi 700 μL mara moja.
muda wa safuwima za kuchuja, centrifuge saa 12,000 rpm (13,800 X g) kwa 30-60 sec.
4. Tupa kichujio na uongeze 300 μL ya Pato la Taifa la Buffer kwenye safu, weka kwenye joto la kawaida kwa dakika 1, centrifuge saa 12,000 rpm (13,800 X g) kwa sekunde 30-60.
5. Tupa kichujio na uongeze 700 μL ya Buffer GW (angalia ikiwa ethanoli kamili imeongezwa mapema!) kwenye safu, centrifuge saa 12,000 rpm (13,800 X g) kwa sekunde 30-60.
Δ Tafadhali ongeza Buffer GW kuzunguka ukuta wa safu ya adsorption, au ongeza kifuniko cha nyuma cha Buffer GW na uchanganye juu chini kwa mara 2 - 3 ili kusaidia kuondoa kabisa chumvi inayoambatana na ukuta wa bomba.
6. Rudia hatua ya 5.
Δ Kusafisha kwa Buffer GW mara mbili kunaweza kuhakikisha kuwa chumvi imeondolewa kabisa na kuondoa athari kwenye majaribio yanayofuata.
7. Tupa filtrate na centrifuge safu tupu saa 12,000 rpm (13,800 X g) kwa 2 min.
8. Ingiza safu kwenye bomba safi la 1.5 ml ya microcentrifuge, ongeza 20 - 30 μL ya Elution Buffer katikati ya membrane ya safu, incubate kwa dakika 2, na kisha centrifuge 12,000 rpm (13,800 X g) kwa dakika 1.Tupa safu, hifadhi DNA iliyopatikana kwa -20.
Δ Kuhamisha nguvu kuu ya hatua ya 8 hadi safu wima ili kufutwa tena na kuwasha joto Kipengele cha Elution hadi 55 (kipande cha DNA kikiwa na > kb 3) kunaweza kusaidia kuongeza ufanisi wa uokoaji.
Mpango wa kurejesha bidhaa za PCR
Itifaki hii inatumika kusafisha vipande vya DNA kutoka kwa bidhaa za PCR, mfumo wa athari ya enzymatic na bidhaa zingine ghafi za DNA (ikiwa ni pamoja na DNA ya kijeni).Suluhisho hili linaweza kuondoa kwa ufanisi nucleotides mbalimbali, primers, primer dimers, molekuli za chumvi, enzymes na uchafu mwingine.
1. Kwa ufupi bidhaa za PCR za centrifuge, suluhisho la mmenyuko wa enzymatic, na bidhaa zingine ghafi za DNA.Kadiria kiasi chao na pipette na uhamishe kwenye sterilized 1.5 ml au 2 ml tube.Ongeza ddH2O hadi ujazo hadi 100 μL;ilhali kwa DNA ya jeni iliyo na umakini wa hali ya juu, kupunguzwa hadi 300 μL na ddH2O kutasaidia kuboresha ufanisi wa uokoaji.
2. Ongeza juzuu 5 za Pato la Taifa la Buffer, changanya vizuri kwa kubadilisha au kugeuza upepo.Ikiwa kipande cha DNA cha riba > bp 100, kiasi cha ziada cha 1.5 (sampuli + Buffer GDP) ya ethanoli kinahitaji kuongezwa.
3. Ingiza safu nyuma kwenye bomba la mkusanyiko, uhamishe mchanganyiko kwenye safu, centrifuge saa 12,000 rpm (13,800 × g) kwa 30 - 60 sec.Ikiwa ujazo wa suluhu iliyochanganyika ni >700 µL, rudisha safu wima ya adsorption kwenye bomba la mkusanyo, hamishia suluhu iliyobaki kwenye safu ya utangazaji, na centrifuge saa 12,000 rpm (13,800 × g) kwa sekunde 30 - 60.
4. Utendaji unaofuata unarejelea hatua ya 5 - 8 ya mpango wa 08- 1/Jeli ya uchimbaji.
Maombi
Viwango mbalimbali vya TAE au TBE agarose gel;Bidhaa za PCR, mifumo ya athari ya enzymatic au bidhaa nyingine ghafi za DNA zilizopatikana kwa mbinu mbalimbali.Vipande vilivyopatikana vilianzia70 bp -20 kb.
Vidokezo
Kwa matumizi ya utafiti tu.Haitumiwi katika taratibu za uchunguzi.
1. Ongeza mililita 80 za ethanoli ili kuongeza Buffer GW kama inavyoonyeshwa kwenye lebo kabla ya matumizi, hifadhi kwenye joto la kawaida.
2. Ikiwa Pato la Taifa la Buffer ni rahisi kunyesha wakati wa hifadhi ya halijoto ya chini, linaweza kuwekwa kwenye halijoto ya kawaida kwa muda kabla ya matumizi.Ikiwa ni lazima, inaweza kuwashwa katika umwagaji wa maji wa 37 ℃ hadi mvua itafutwa kabisa, na kisha inaweza kutumika baada ya kuchanganya.
3. Weka joto la umwagaji wa maji hadi 50 ~ 55 ℃ mapema.
4. Katika hatua ya 1 ya hatua ya 1 ya 08-1/Jeli ya uchimbaji, kupunguza ukubwa wa kipande cha gel kutapunguza kwa kiasi kikubwa muda wa kuyeyusha na kuongeza ufanisi wa uokoaji (DNA iliyosawazishwa ni rahisi kutoa hidrolisisi inapofunuliwa kila mara kwa joto la juu).Usiweke gel ya DNA kwenye UV kwa muda mrefu, kwani mwanga wa ultraviolet unaweza kusababisha uharibifu wa DNA.
5. Futa gel katika mpango wa 08- 1/Gel uchimbaji hatua ya 2 kabisa, vinginevyo ufanisi wa kurejesha DNA utaathirika sana.
6. Preheat Elution Buffer au ddH2O hadi 55℃ , ambayo inasaidia kuboresha ufanisi wa DNA elution.Inapendekezwa kuhifadhi DNA katika 2.5 mM Tris-HCl, pH 7.0 - 8.5.
