EndoFree Plasmid Maxi Kit
Seti hii inafaa kwa uchimbaji kutoka 150 - 300 ml ya suluhisho la bakteria lililopandwa usiku mmoja, kwa kutumia njia iliyoboreshwa ya SDS-alkali ya lyse ya bakteria.Dondoo ghafi hujumuishwa kwa kuchagua na Scavenger ya kipekee ya Endotoxin na kutenganishwa kwa uwekaji katikati ili kuondoa endotoksini.Kisha, utando wa jeli ya silika hujifunga kwa DNA ya plasmid katika myeyusho chini ya hali ya chumvi nyingi na pH ya chini.Hii inafuatwa na kuongeza bafa ya kuosha ili kuondoa uchafu na viambajengo vingine vya bakteria.Hatimaye, bafa yenye chumvi kidogo na pH ya juu inatumiwa kutoa DNA safi ya plasmid kutoka kwa membrane ya tumbo ya silicon.Utando wa jeli ya silika hutumia utando maalum wa utangazaji, na tofauti ya kiasi cha adsorption kati ya safu na safu ni ndogo sana na uwezo wa kujirudia ni mzuri.Phenoli, klorofomu na vitendanishi vingine vya sumu havitakiwi, na pia hatua za kunyesha kwa ethanoli hazihitajiki.Seti hii inaweza kutumika kutoa kwa haraka 0.2 -1.5 mg ya DNA safi ya nakala ya juu ya plasmid, na kiwango cha uchimbaji cha 80% -90%.Seti hutumia fomula ya kipekee ya mchakato huondoa endotoxin, yaliyomo kwenye endotoxin ni ya chini sana na athari ya uhamishaji wa seli ni bora.Plasidi iliyotolewa inaweza kutumika moja kwa moja katika usagaji wa kimeng'enya, PCR, unukuzi wa in vitro, ugeuzaji, mpangilio na majaribio mengine ya baiolojia ya molekuli.
Masharti ya kuhifadhi
RNaseA inapaswa kuhifadhiwa kwa -30 ~ -15℃ na kusafirishwa kwa ≤0℃ .
Endotoxin Scavenger inaweza kuhifadhiwa kwa 2 ~ 8℃ kwa mwezi mmoja, kuhifadhiwa kwa -30 ~ -15 ℃ kwa uhifadhi wa muda mrefu.na kusafirishwa kwa ≤0℃ .
Vipengele vingine vinapaswa kuhifadhiwa kwenye joto la kawaida (15 ~ 25 ℃) na kusafirishwa kwa joto la kawaida.
Vipengele
| Vipengele | 10RXNS |
| RNase A | 750 μL |
| Buffer P1 | 75 ml |
| Buffer P2 | 75 ml |
| Buffer P4 | 75 ml |
| Endotoxin Scavenger | 25 ml |
| Bafa PW | 2 × 22 ml |
| Kifafa TB | 20 ml |
| Safu wima za FastPure za DNA (Kila katika Tube ya Mkusanyiko ya 50ml) | 10 |
| Tube ya Mkusanyiko isiyo na Endotoxin | 2 × 5 |
RNaseA:10 mg/ml, inayotumika kuondoa RNA.
Buffer P1:bafa ya kusimamishwa kwa bakteria, ongeza RNaseA kwenye Buffer P1 kabla ya matumizi ya kwanza.
Buffer P2:bafa ya lysis ya bakteria (iliyo na SDS/NaOH).
Buffer P4:bafa ya kugeuza.
Endotoxin Scavenger:kwa ufanisi kuondoa endotoxin kutoka kwa dondoo ghafi ya plasmid.
Bafa PW:osha bafa, ongeza kiwango kilichoainishwa cha ethanoli kabla ya matumizi ya kwanza.
TB bafa:bafa ya elution.
Safu wima za Maxi za FastPure:safu wima za utangazaji za plasmid.
Mirija ya Mkusanyiko 50 ml:mirija ya kukusanya filtrate.
Tube ya Mkusanyiko isiyo na Endotoxin:mirija ya kukusanya DNA ya plasmid.
Nyenzo Zilizotayarishwa
Ethanoli kabisa, isopropanoli, mirija ya centrifuge ya duara ya mililita 50 na 50 ml isiyo na endotoxin.zilizopo za centrifuge.
Maombi
Bidhaa hii inafaa kwa uchimbaji mkubwa wa plasmids kutoka 150 - 300 ml ya suluhisho la bakteria.utamaduni mara moja.
Mchakato wa Majaribio
1. Chukua 150 - 200 ml (si zaidi ya 300 ml) ya suluhisho la bakteria lililopandwa usiku mmoja na centrifuge saa.kuhusu 11,000 rpm (12,000 × g) kwa 1 - 2 min.Tupa nguvu kuu na kukusanya bakteria.
Δ Wakati wa kukusanya zaidi ya 50 ml ya mmumunyo wa bakteria, bakteria wanaweza kukusanywa kwa kuongeza ufumbuzi wa bakteria, centrifugation, kutupa supernatant na hatua nyingine katika 50 ml tube moja kwa ajili ya.
mara nyingi.
2. Ongeza 7.5 ml ya Buffer P1 (tafadhali angalia ikiwa RNaseA imeongezwa kwenye Buffer P1) kwenye centrifugetube iliyo na bakteria na kuchanganya vizuri na vortex au pipetting.
Δ Urejesho kamili wa bakteria katika hatua hii ni muhimu kwa mavuno, na haipaswi kuwa na makundi ya bakteria baada ya kusimamishwa tena.Ikiwa kuna makundi ya bakteria ambayo hayajachanganywa kabisa, itaathiri lysis, na kusababisha mavuno ya chini na usafi.Ikiwa OD600 ya ufumbuzi wa bakteria ni 0.65, inashauriwa kuwa 7.5 ml ya Buffer P1 itumike wakati wa kutoa kutoka kwa 150 ml ya ufumbuzi wa bakteria;wakati OD600 ni 0.75, 8 ml ya Buffer P1 inapaswa kutumika na ujazo wa Buffers P2 na P4 unapaswa kubadilishwa ipasavyo.Ikiwa kiasi cha suluhisho la bakteria kinaongezeka hadi 200 ml, inashauriwa kuwakiasi cha Buffers P1, P2, na P4 kiongezwe sawia.
3. Ongeza 7.5 ml ya Buffer P2 kwa kusimamishwa kwa bakteria kutoka hatua ya 2 na changanya kwa upole juu na chini kwa 6 - 8.mara kwa mara na uanguke kwenye joto la kawaida kwa dakika 4 - 5.
Δ Geuza kwa upole ili kuchanganya vizuri.Vortexing itasababisha mgawanyiko wa DNA ya jenomu, na kusababisha vipande vya DNA vya jeni katika plasmid iliyotolewa.Kwa wakati huu, suluhisho inakuwa ya viscous na translucent, kuonyesha kwamba bakteria wamekuwa lysed kikamilifu.Muda haupaswi kuzidi dakika 5 ili kuzuia uharibifu wa plasmids.Ikiwa suluhisho haliko wazi, kunaweza kuwa na bakteria nyingi zinazosababishalysis isiyo kamili, hivyo kiasi cha bakteria kinapaswa kupunguzwa ipasavyo.
4. Ongeza 7.5 ml ya Buffer P4 kwa kusimamishwa kwa bakteria kutoka hatua ya 3 na mara moja pindua kwa upole mara 6 - 8 ili kuruhusu suluhisho kugeuza kabisa Buffer P2.Kwa wakati huu, mvua nyeupe ya flocculent inapaswa kuonekana.Centrifuge kwa zaidi ya 11,000 rpm (12,000 × g) kwa dakika 10 - 15, ingiza kwa uangalifu dawa ya juu kwenye bomba mpya la mililita 50 la duara-chini la centrifuge (iliyojitayarisha), na epuka.kutamani mvua nyeupe inayoelea.
Δ Ongeza Buffer P4 na ugeuze mara moja ili uchanganye vizuri.Acha mrija usimame hadi mvua nyeupe isambazwe sawasawa katika suluhisho ili kuzuia uzalishwaji wa mvua ya ndani ambayo inaweza kuathiri upunguzaji.Iwapo hakuna mteremko wa flocculent nyeupe sare kabla ya kupenyeza katikati na ile ya juu zaidi haiko wazi baada ya kupenyeza katikati, mrija unaweza kuwaweka katikati kwa dakika 5 nyingine.
5. Ongeza 0. mara 1 ya ujazo (10% ya ujazo wa nguvu kupita kiasi, karibu 2.2 ml) ya Endotoxin Scavenger hadi supernatant kutoka hatua ya 4 na geuza ili kuchanganya.Weka suluhisho kwenye umwagaji wa barafu au ingiza kwenye barafu iliyokandamizwa (au jokofu) kwa dakika 5 hadi suluhisho libadilike kutoka kwa machafu hadi kuwa wazi na uwazi (au bado.chafu kidogo), na mara kwa mara changanya mara kadhaa.
Δ Baada ya Endotoxini Scavenger kuongezwa kwa nguvu kuu, nguvu kuu itachafuka lakinidawa ya juu inapaswa kuwa wazi (au chafu kidogo) baada ya kupoa kwenye umwagaji wa barafu.
6. Baada ya nguvu ya juu kuwekwa kwenye joto la kawaida (>25 ℃) kwa dakika 10 - 15, kutakuwa na machafukojoto lake huongezeka hadi joto la kawaida.Kisha nguvu kuu inapaswa kugeuzwa ili kuchanganya.
Δ Ikiwa halijoto ya chumba ni ya chini au unataka kupunguza muda wa uchimbaji, dawa ya nguvu ya juu inaweza kuangaziwa katika umwagaji wa maji wa 37 ~ 42 ℃ kwa dakika 5 - 10 na hatua inayofuata inaweza kufanywa baada ya supernatant.inakuwa machafuko.
7. Weka nguvu ya juu kwa kasi ya 11,000 rpm (12,000 × g) kwa dakika 10 kwenye joto la kawaida (joto lazima liwe >25℃) ili kutenganisha awamu.Awamu ya juu ya maji ina DNA wakati safu ya chini ya bluu ya mafuta ina endotoxin na uchafu mwingine.KuhamishaAwamu ya maji yenye DNA kwa bomba mpya naondoa safu ya mafuta.
Δ Halijoto wakati wa kupenyeza katikati lazima iwe zaidi ya 25℃ kwani utenganisho wa awamu haufanyi hivyokutokea ikiwa hali ya joto ni ya chini sana.
Δ Ikiwa mgawanyo wa awamu haufanyi kazi, halijoto ya kupenyeza inaweza kubadilishwa hadi 30℃ nawakati wa centrifugation inaweza kuongezeka hadi 15 min.
Δ Usinyonye safu ya mafuta ya buluu kwani ina endotoksini na uchafu mwingine.
Utaratibu
Kusimamishwa kwa Lysis Neutralization
◇ Ongeza 7.5 ml Buffer P1
◇ Ongeza 7.5 ml Buffer P2
◇ Ongeza 7.5 ml Buffer P4
Kuondolewa kwa endotoxin
◇Ongeza 0. mara 1 ya ujazo wa ajabu wa Endotoxin Scavenger
Kufunga na Kuosha
◇ Ongeza mara 0.5 ya ujazo wa isopropanoli
◇ Ongeza 10 ml Buffer PW
◇ Ongeza 10 ml Buffer PW
Elution
◇ Ongeza 1 - 2 ml Buffer TB au ddH2O isiyo na Endotoxin
