Protini K (Kioevu)
Nambari ya paka: HC4502A
Proteinase K ni protini thabiti ya serine na umaalum mpana wa substrate.Inaharibu protini nyingi katika hali ya asili hata mbele ya sabuni.Ushahidi kutoka kwa tafiti za fuwele na muundo wa molekuli unaonyesha kuwa kimeng'enya ni cha familia ya subtilisin iliyo na sehemu tatu ya kichocheo cha tovuti (Asp.39-Yake69- Seva224)Eneo kuu la kupasuka ni kifungo cha peptidi kilicho karibu na kikundi cha kaboksili cha asidi ya amino ya alifati na yenye kunukia yenye vikundi vya alpha amino vilivyozuiwa.Ni kawaida kutumika kwa upana wakemaalum.
Vipimo
| Mwonekano | Kioevu kisicho na rangi hadi hudhurungi |
| Shughuli | ≥800 U/ml |
| Mkusanyiko wa protini | ≥20 mg/ml |
| DNase | Hakuna iliyotambuliwa |
| RNase | Hakuna iliyotambuliwa |
Masharti ya Uhifadhi
Hifadhi kwa joto la 2-8 ℃.
Mali
| Nambari ya EC | 3.4.21.64 (Rpamoja na albamu ya Tritirachium) |
| Uzito wa Masi | kDa 29 (SDS-PAGE) |
| Pointi ya Isoelectric | 7.81 |
| pH bora zaidi | 7.0-12.0 Mtini.1 |
| Joto bora zaidi | 65 ℃ Mtini.2 |
| utulivu wa pH | pH 4.5-12.5 (25℃, 16 h) Mtini.3 |
| Utulivu wa joto | Chini ya 50℃ (pH 8.0, dakika 30) Mtini.4 |
| Vianzishaji | SDS, urea |
| Vizuizi | Diisopropyl fluorophosphate;phenylmethylsulfonyl fluoride |
Maombi
1. Seti ya uchunguzi wa maumbile
2. Vifaa vya uchimbaji wa RNA na DNA
3. Uchimbaji wa vipengele visivyo vya protini kutoka kwa tishu, uharibifu wa uchafu wa protini, kama vile chanjo za DNA na maandalizi ya heparini.
4. Maandalizi ya DNA ya chromosome kwa electrophoresis ya pulsed
5. Waa wa Magharibi
6. Vitendanishi vya albin ya glycosylated ya enzymatic in vitro utambuzi
Tahadhari
Vaa glavu za kujikinga na miwani unapotumia au kupima uzani, na uweke hewa ya kutosha baada ya kutumia.Bidhaa hii inaweza kusababisha athari ya mzio wa ngozi na kuwasha kwa macho.Ikivutwa, inaweza kusababisha mzio au dalili za pumu au dyspnea.Inaweza kusababisha kuwasha kwa kupumua.
Uchunguzi
Ufafanuzi wa kitengo
Kitengo kimoja (U) kinafafanuliwa kuwa kiasi cha kimeng'enya kinachohitajika ili hidrolisisi kasini kutoa 1 μmol tyrosine kwa dakika chini ya hali zifuatazo.
Maandalizi ya vitendanishi
Kitendanishi I: 1g ya kasini ya maziwa iliyeyushwa katika 50ml ya 0.1M ya suluji ya sodiamu ya fosforasi (pH 8.0), ikawekwa ndani ya 65-70 ℃ maji kwa dakika 15, ikikorogwa na kufutwa, kupozwa na maji, kurekebishwa na hidroksidi ya sodiamu hadi pH8.0, na kudumu kiasi cha 100 ml.
Kitendawili II: TCA myeyusho:0.1M trikloroasetiki asidi, 0.2M sodiamu acetate, 0.3M asidi asetiki.
Kitendanishi III: 0.4M Na2CO3suluhisho.
Reagent IV: Forint reagent diluted kwa maji safi kwa mara 5.
Kitendanishi V: Kiyeyushaji cha kimeng'enya: 0.1M myeyusho wa fosfeti ya sodiamu (pH 8.0).
Reagent VI: Suluhisho la Tyrosine:0, 0.005, 0.025, 0.05, 0.075, 0.1, 0.25 umol/ml tyrosine iliyoyeyushwa na 0.2M HCl.
Utaratibu
1. 0.5ml ya reagent I huwashwa kabla ya joto hadi 37℃, ongeza 0.5ml ya myeyusho wa kimeng'enya, changanya vizuri, na uangulie kwenye 37℃ kwa dakika 10.
2. Ongeza 1ml ya reagent II ili kukomesha majibu, changanya vizuri, na endelea incubation kwa 30mins.
3. Suluhisho la mmenyuko wa Centrifugate.
4. Kunywa 0.5ml supernatant, ongeza 2.5ml reagent III, 0.5ml reagent IV, changanya vizuri na incuate katika 37℃ kwa 30mins.
5. OD660iliamuliwa kama OD1;kikundi tupu cha udhibiti: 0.5ml reagent V hutumiwa kuchukua nafasi ya ufumbuzi wa enzyme kuamua OD660kama OD2, ΔOD=OD1-OD2.
6. Mkunjo wa kiwango cha L-tyrosine: 0.5mL myeyusho tofauti wa L-tyrosine, 2.5mL Reagent III, 0.5mL Reagent IV katika 5mL tube centrifuge, incubate katika 37℃ kwa dakika 30, tambua kwa OD660kwa mkusanyiko tofauti wa L-tyrosine, kisha kupata mkunjo wa kawaida Y=kX+b, ambapo Y ni mkusanyiko wa L-tyrosine, X ni OD600.
Hesabu
2: Jumla ya ujazo wa suluhisho la majibu (mL)
0.5: Kiasi cha myeyusho wa kimeng'enya (mL)
0.5: Kiasi cha majibu ya kioevu kinachotumika katika uamuzi wa kromojeni (mL)
10: Muda wa kujibu (dakika)
Df: Dilution nyingi
C: Mkusanyiko wa enzyme (mg/mL)
Marejeleo
1. Wieger U & Hilz H. FEBS Lett.(1972);23:77.
2. Wieger U & Hilz H. Biochem.Wasifu.Res.Jumuiya.(1971);44:513.
3. Hilz, H.na wengine.,Eur.J. Biochem.(1975);56:103–108.
4. Sambrook Jet al., Uunganishaji wa Molekuli: Mwongozo wa Maabara, toleo la 2, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Bandari ya Majira ya baridi (1989).
Takwimu
Mtini. 1 Optimum pH
Ufumbuzi wa bafa wa 100mM: pH6.0-8.0, Na-fosfati;pH8.0- 9.0, Tris-HCl;pH9.0-12.5, Glycine-NaOH.Kielelezo cha Enzyme:1mg/mL
Mtini. 2 Hali bora ya joto
Mwitikio katika 20mM K-fosfati bafa pH 8.0.Mkusanyiko wa enzyme: 1mg/mL
Mtini. 3 pH Utulivu
25℃,16 h-matibabu yenye ufumbuzi wa bafa wa 50mM: pH 4.5-5.5, Acetate;pH 6.0-8.0, Na-phosphate;pH 8.0-9.0, Tris-HCl.pH 9.0-12.5, Glycine-NaOH.Mkusanyiko wa enzyme: 1mg/mL
Mchoro 4 wa joto utulivu
Matibabu ya dakika 30 na bafa ya 50mM Tris-HCl, pH 8.0.Mkusanyiko wa enzyme: 1mg/mL
Mtini. 5 Hifadhi utulivuty at 25℃
