M-MLV Neoscript Reverse Transcriptase
Neoscript Reverse Transcriptase ni nakala ya kinyume iliyopatikana kwa uchunguzi wa mabadiliko wa jeni la M-MLV la asili ya virusi vya leukemia ya Moloney murine na kujieleza katika E.coli.Kimeng'enya huondoa shughuli ya RNase H, ina uwezo wa kustahimili halijoto ya juu, na inafaa kwa unukuzi wa kinyume cha halijoto ya juu.Kwa hivyo, ni muhimu kwa kuondoa athari zisizofaa za muundo wa kiwango cha juu cha RNA na sababu zisizo maalum kwenye usanisi wa cDNA, na ina uthabiti wa juu na uwezo wa kusanisi wa unukuzi wa kinyume.Kimeng'enya kina uthabiti wa juu na uwezo wa uandishi wa unukuzi wa kinyume.
Vipengele
1.200 U/μL New Transcriptase Reverse Transcriptase
2.5 × Bafa ya Msururu wa Kwanza (si lazima)
* 5 × First-Strand Buffer haina dNTP, tafadhali ongeza dNTP wakati wa kuandaa mfumo wa majibu.
Programu Iliyopendekezwa
1.qRT-PCR ya hatua moja.
2.Utambuzi wa virusi vya RNA.
Hali ya Uhifadhi
-20°C kwa uhifadhi wa muda mrefu, inapaswa kuchanganywa vizuri kabla ya matumizi, epuka kufungia mara kwa mara.
Ufafanuzi wa Kitengo
Kizio kimoja hujumuisha nmol 1 ya dTTP katika dakika 10 kwa 37°C kwa kutumia poly(A)•oligo(dT)25kama template/ primer.
Udhibiti wa Ubora
1.Usafi wa kielektroniki wa SDS-PAGE zaidi ya 98%.
2.Usikivu wa kukuza, udhibiti wa kundi-kwa-batch, utulivu.
3.Hakuna shughuli ya viini vya nje, hakuna endonuclease ya nje au uchafuzi wa exonuclease
Mipangilio ya Mwitikio kwa Suluhisho la Mwitikio wa Msururu wa Kwanza
1.Maandalizi ya mchanganyiko wa majibu
| Vipengele | Kiasi |
| Oligo(dT)12-18 Primer au Primer bila mpangilioa Au Gene Specific Primersb | 50 pmol |
| 50 pmol (20-100 pmol) | |
| 2 pmoli | |
| 10 mm dNTP | 1 μL |
| Kiolezo cha RNA | Jumla ya RNA≤ 5μg;mRNA≤ 1 μg |
| RNase-bure dH2O | Hadi 10 μL |
Vidokezo:a/b: Tafadhali chagua aina tofauti za vianzio kulingana na mahitaji yako ya majaribio.
2.Joto kwa 65 ° C kwa dakika 5 na baridi haraka kwenye barafu kwa dakika 2.
3.Ongeza vipengele vifuatavyo kwenye mfumo ulio hapo juu kwa jumla ya ujazo wa 20µL na uchanganye kwa upole:
| Vipengele | Kiasi (μL) |
| 5 × Bafa ya Msururu wa Kwanza | 4 |
| Neoscript Reverse Transcriptase (200 U/μL) | 1 |
| Kizuizi cha RNase (40 U/μL) | 1 |
| RNase-bure dH2O | Hadi 20 μL |
4. Tafadhali fanya majibu kulingana na masharti yafuatayo:
(1) Ikiwa Primer Nasibu inatumiwa, majibu yanapaswa kufanywa kwa 25℃ kwa dakika 10, na kisha kwa 50℃ kwa 30 ~ 60mins;
(2) Iwapo Oligo dT au vianzio mahususi vinatumiwa, majibu yanapaswa kufanywa kwa 50℃ kwa dakika 30~60.
5.Joto kwa 95℃ kwa dakika 5 ili kuzima Neoscript Reverse Transcriptase na kukomesha majibu.
6.Bidhaa za unukuzi wa kinyume zinaweza kutumika moja kwa moja katika maitikio ya PCR na athari ya upimaji wa PCR ya fluorescence, au kuhifadhiwa kwa -20℃ kwa muda mrefu.
PCR Rhatua:
1.Maandalizi ya mchanganyiko wa majibu
| Vipengele | Kuzingatia |
| 10 × PCR Buffer (dNTP bila malipo, Mg²+ bila malipo) | 1× |
| dNTP (10mM kila dNTP) | 200 μM |
| 25 mm MgCl2 | 1-4 mm |
| Taq DNA Polymerase (5U/μL) | 2-2.5 U |
| Primer 1 (10 μM) | 0.2-1 μM |
| Primer 2 (10 μM) | 0.2-1 μM |
| Kiolezoa | ≤10% Suluhisho la Majibu ya Msururu wa Kwanza (2 μL) |
| ddH2O | Hadi 50 μL |
Vidokezo:a: Ikiwa suluhisho la mmenyuko mwingi wa kwanza litaongezwa, mmenyuko wa PCR unaweza kuzuiwa.
2.Utaratibu wa Majibu ya PCR
| Hatua | Halijoto | Wakati | Mizunguko |
| Pre-denaturation | 95℃ | Dakika 2-5 | 1 |
| Denaturation | 95℃ | 10-20 sek | 30-40 |
| Annealing | 50-60 ℃ | 10-30 sek | |
| Ugani | 72℃ | 10-60 sek |
Vidokezo
1.Inafaa kwa uboreshaji wa halijoto ya unukuzi wa kinyume katika masafa ya 42℃~55℃.
2.Ina uthabiti bora, inafaa kwa ukuzaji wa maandishi ya hali ya juu ya hali ya juu.Kwa kuongeza, ni nzuri kwa kupita kwa ufanisi katika mikoa tata ya miundo ya RNA.Pia, niinafaa kwa ugunduzi wa kiasi wa RT-PCR wa hatua moja wa fluorescence.
3.Utangamano mzuri na vimeng'enya mbalimbali vya ukuzaji wa PCR na inafaa kwa miitikio ya RT-PCR yenye unyeti mkubwa.
4.Inafaa kwa usikivu wa juu wa hatua moja ya mmenyuko wa kiasi cha RT-PCR wa fluorescence, kuboresha kwa ufanisi kiwango cha ugunduzi wa mkusanyiko mdogo wa violezo.
5.Inafaa kwa ujenzi wa maktaba ya cDNA.
