Enzyme ya Kuzuia Virusi vya Vaccinia

Kimeng'enya cha kuzuia virusi vya vaccinia hutokana na aina nyingine ya E. koli hubeba jeni za kimeng'enya cha Vaccinia.Kimeng'enya hiki kimoja kinajumuisha vijisehemu viwili (D1 na D12) na vina shughuli tatu za enzymatic (RNA triphosphatase na guanylyltransferase na kitengo kidogo cha D1 na guanine methyltransferase na kitengo kidogo cha D12).Vaccinia virus Capping Enzyme ni nzuri katika kuchochea uundaji wa muundo wa kofia, ambayo inaweza kuambatanisha haswa muundo wa kofia ya 7-methylguanylate (m7Gppp, Cap 0) hadi mwisho wa 5′ wa RNA.Muundo wa kofia (Sura ya 0) ina jukumu muhimu katika uimarishaji wa mRNA, usafiri na tafsiri katika yukariyoti.Kuweka alama za RNA kwa mmenyuko wa enzymatic ni njia bora na rahisi ambayo inaweza kuboresha kwa kiasi kikubwa uthabiti na tafsiri ya RNA kwa unukuzi wa in vitro, uhamishaji na sindano ndogo.

Vipengele

Enzyme ya Kuzuia Virusi vya Vaccinia (10 U/μL)

10×Capping Buffer

Masharti ya kuhifadhi

-25～- 15℃ kwa kuhifadhi (Epuka mizunguko ya kufungia-yeyusha mara kwa mara)

Bafa ya hifadhi

20 mm Tris-HCl (pH 8.0), 100 mm NaCl,

1mM DTT, 0. 1mM EDTA, 0. 1% Triton X- 100, 50% glycerol.

Ufafanuzi wa Kitengo

Kitengo kimoja cha Enzyme ya Kupunguza Virusi vya Vaccinia inafafanuliwa kuwa kiasi cha kimeng'enya kinachohitajika ili kujumuisha 10pmol ya GTP kwenye nakala ya 80nt katika saa 1 katika 37°C.

Udhibiti wa Ubora

Exonuclease:10U ya Virusi vya Vaccinia Capping Enzyme yenye 1μg λ-Hind III ya kusaga DNA ifikapo 37 ℃ kwa saa 16 haitoi uharibifu wowote kama inavyobainishwa na electrophoresis ya gel ya agarose.

Endonuclease:10U ya Virusi vya Vaccinia Capping Enzyme yenye 1μg λDNA katika 37℃ kwa saa 16 haitoi uharibifu kama inavyobainishwa na electrophoresis ya jeli ya agarose.

Nickase:10U ya Virusi vya Vaccinia Capping Enzyme yenye 1 μg pBR322 saa 37 ℃ kwa saa 16 haitoi uharibifu wowote kama inavyobainishwa na electrophoresis ya jeli ya agarose.

RNase:10U ya Virusi vya Vaccinia Capping Enzyme yenye 1.6μg MS2 RNA kwa saa 4 katika 37℃ haitoi uharibifu kama inavyobainishwa na electrophoresis ya jeli ya agarose.

1.coli DNA:10U ya Virusi vya Vaccinia Capping Enzyme inakaguliwa kwa uwepo wa E. coli genomic DNA kwa kutumia TaqMan qPCR yenye vianzio maalum kwa E. coli 16S rRNA locus.Uchafuzi wa DNA ya E. koli ni≤1 E. koli genome.

2.Bakteria Endotoxin: Jaribio la LAL, kulingana na toleo la Kichina la Pharmacopoeia IV 2020, njia ya mtihani wa kikomo cha gel, kanuni ya jumla (1143).Maudhui ya endotoxin ya bakteria yanapaswa kuwa ≤10 EU/mg.

Mfumo wa majibu na masharti

1. Itifaki ya Kudhibiti (kiasi cha majibu: 20 μL)

Utaratibu huu unatumika kwa athari ya 10μg RNA (≥100 nt) na inaweza kuongezwa kulingana na mahitaji ya majaribio.

I) Changanya 10μg RNA na H2O isiyo na Nuclease katika tube ya mikrofuge ya 1.5 ml hadi ujazo wa mwisho wa 15.0 µL.*10×Capping Buffer: 0.5M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mm MgCl2, 10 mM DTT, (25℃, pH 8.0)

2) Joto kwa 65 ℃ kwa dakika 5 ikifuatiwa na umwagaji wa barafu kwa dakika 5.

3) Ongeza vipengele vifuatavyo kwa mpangilio ulioainishwa

*10×Capping Buffer:0.5 M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mm MgCl2, 10 mm DTT, (25℃, pH8.0)

4) Ingiza kwa 37°C kwa dakika 30, RNA sasa imefunikwa na iko tayari kwa matumizi ya chini ya mkondo.

2. 5′ terminal majibu ya kuweka lebo (kiasi cha majibu: 20 μL)

Itifaki hii imeundwa kuweka lebo ya RNA iliyo na trifosfati 5 na inaweza kuongezwa kulingana na mahitaji.Ufanisi wa ujumuishaji wa lebo utaathiriwa na uwiano wa molar wa RNA: GTP, pamoja na maudhui ya GTP katika sampuli za RNA.

1) Changanya kiasi kinachofaa cha RNA na H2O isiyo na Nuclease katika mirija ya mikrofuge ya mililita 1.5 hadi ujazo wa mwisho wa 14.0 µL.

2) Joto kwa 65 ℃ kwa dakika 5 ikifuatiwa na umwagaji wa barafu kwa dakika 5.

3)Ongeza vipengele vifuatavyo kwa mpangilio ulioainishwa.

** GTP MIX inarejelea GTP na idadi ndogo ya vialamisho.Kwa mkusanyiko wa GTP, rejeleakwa Kumbuka 3.

4) Ingiza kwa 37°C kwa dakika 30, mwisho wa RNA 5′ umewekwa lebo na tayari kwa mkondo wa chini.

Maombi

1. Kuweka alama kwenye mRNA kabla ya majaribio ya tafsiri/utafsiri wa ndani

2. Kuweka alama 5' mwisho wa mRNA

Vidokezo vya matumizi

1.Kupasha joto myeyusho wa RNA kabla ya kuangukiwa na Enzyme ya Kupunguza Vaccinia huondoa muundo wa pili kwenye 5'mwisho wa nakala.Ongeza muda hadi dakika 60 kwa manukuu yenye ncha 5 zenye muundo wa hali ya juu.

2. RNA inayotumika kwa miitikio ya kufunika inapaswa kusafishwa kabla ya matumizi na kusimamishwa katika maji yasiyo na viini.EDTA haipaswi kuwepo na ufumbuzi unapaswa kuwa bila chumvi.

3. Kwa kuweka lebo ya 5′ mwisho, jumla ya mkusanyiko wa GTP inapaswa kuwa karibu mara 1-3 ya mkusanyiko wa molar ya mRNA katika majibu.

4. Kiasi cha mfumo wa majibu kinaweza kuongezwa juu au chini kulingana na halisi.