PNGse F
Peptide-N-Glycosidase F(PNGase F) ndiyo njia bora zaidi ya enzymatic ya kuondoa karibu oligosaccharides zote zilizounganishwa na N kutoka kwa glycoproteini.PNGase F ni amidase, ambayo hupasuliwa kati ya GlcNAc nyingi za ndani na mabaki ya asparagine ya mannose ya juu, mseto, na oligosaccharides changamano kutoka glycoproteini zilizounganishwa na N.
Maombi
Enzyme hii ni muhimu kwa kuondolewa kwa mabaki ya wanga kutoka kwa protini.
Maandalizi na vipimo
| Mwonekano | Kioevu kisicho na rangi |
| Usafi wa protini | ≥95% (kutoka SDS-PAGE) |
| Shughuli | ≥500,000 U/mL |
| Exoglycosidase | Hakuna shughuli ingeweza kutambuliwa (ND) |
| Endoglycosidase F1 | ND |
| Endoglycosidase F2 | ND |
| Endoglycosidase F3 | ND |
| Endoglycosidase H | ND |
| Protease | ND |
Mali
| Nambari ya EC | 3.5.1.52(Recombinant kutoka microorganism) |
| Uzito wa Masi | 35 kDa (SDS-PAGE) |
| Pointi ya Isoelectric | 8. 14 |
| pH bora zaidi | 7.0-8.0 |
| Joto bora zaidi | 65 °C |
| Umaalumu wa substrate | Kuondoa vifungo vya glycosidic kati ya GlcNAc na mabaki ya asparagine Mtini.1 |
| Maeneo ya utambuzi | Glyans zilizounganishwa na N isipokuwa ikiwa na α1-3 fucose Kielelezo 2 |
| Vianzishaji | DTT |
| Kizuizi | SDS |
| Halijoto ya kuhifadhi | -25 ~-15 ℃ |
| Kuzima joto | Mchanganyiko wa mmenyuko wa 20µL ulio na 1µL ya PNGse F huwashwa kwa kuamilishwa kwa 75 °C kwa dakika 10. |
Kielelezo cha 1 Umaalumu wa Substrate ya PNGse F
Kielelezo cha 2 Siti za Utambuzi za PNGse F.
Wakati mabaki ya GlcNAc ya ndani yanapounganishwa na α1-3 fucose, PNGase F haiwezi kupasua oligosaccharides zilizounganishwa na N kutoka kwa glycoproteini.Marekebisho haya ni ya kawaida katika mimea na baadhi ya glycoproteini ya wadudu.
Cwapinzani
|
| Vipengele | Kuzingatia |
| 1 | PNGse F | 50µl |
| 2 | 10×Glycoprotein Denaturing Buffer | 1000µl |
| 3 | 10×GlycoBuffer 2 | 1000µl |
| 4 | 10% NP-40 | 1000µl |
Ufafanuzi wa kitengo
Kizio kimoja (U) kinafafanuliwa kuwa kiasi cha kimeng'enya kinachohitajika ili kuondoa >95% ya kabohaidreti kutoka 10 µg ya RNase B iliyobadilishwa kwa saa 1 katika 37°C katika jumla ya ujazo wa 10 µL.
Masharti ya majibu
1.Yeyusha 1-20 µg ya glycoprotein kwa maji yaliyotolewa, ongeza 1 µl 10×Glycoprotein Denaturing Buffer na H2O (ikiwa ni lazima) ili kufanya jumla ya majibu ya 10 µl.
2.Ingiza kwa 100 ° C kwa dakika 10, baridi kwenye barafu.
3.Ongeza 2 µl 10×GlycoBuffer 2, 2 µl 10% NP-40 na uchanganye.
4.Ongeza 1-2 µl PNGse F na H2O (ikiwa ni lazima) kutengeneza 20 µl jumla ya ujazo na uchanganye.
5.Ingiza mmenyuko kwa 37°C kwa dakika 60.
6.Kwa uchanganuzi wa SDS-PAGE au uchanganuzi wa HPLC.
