mRNA Cap2'-O-Methyltransferase

mRNA Cap 2′ -O-methyltransferase ilitokana na aina ya E. koli inayojumuisha ambayo hubeba jeni ya chanjo ya mRNA Cap 2 ´-O-Methyltransferase.Kimeng'enya hiki huongeza kikundi cha methyl kwenye nafasi ya 2'-O ya nyukleotidi ya kwanza iliyo karibu na muundo wa kofia kwenye 5'mwisho wa RNA. Kimeng'enya hiki hutumia S-adenosylmethionine (SAM) kama mtoaji wa methyl kwa RNA iliyofungwa kwa methylate (cap. -0) kusababisha muundo wa cap- 1.

Muundo wa Cap1 unaweza kuongeza ufanisi wa utafsiri, kuboresha usemi wa mRNA katika majaribio ya uhamishaji na sindano ndogo. Kimeng'enya hiki kinahitaji RNA haswa yenye kifuniko cha m7GpppN kama substrate.Haiwezi kutumia RNA na pN, ppN, pppN au GpppN mwishoni mwa 5′.RNA iliyofungwa inaweza kutayarishwa kupitia unukuzi wa in vitro kwa kutumia cap analogi au kupitia enzymatic capping kwa kutumia Vaccinia Capping Enzyme.

Vipengele

mRNA Cap 2'-O-Methyltransferase (50U/μL)

10×Akiba ya Mwitikio wa Kupunguza Kina

Hifadhi

-25 ～- 15℃ kwa kuhifadhi (Epuka mizunguko ya kufungia-yeyusha mara kwa mara)

Bafa ya hifadhi

20 mM Tris-HCl(pH 8.0,25℃), 100 mM NaCl, 1 mm DTT, 0. 1 mm EDTA, 0. 1% Triton X- 100, 50% glycerol.

Ufafanuzi wa kitengo

Kitengo kimoja kinafafanuliwa kuwa kiasi cha kimeng'enya kinachohitajika kutengenezea pmoles 10 za nakala 80 za RNA iliyofungwa kwa saa 1 katika 37°C.

Vipimo vya udhibiti wa ubora

Exonuclease:50U ya mRNA Sura ya 2 ´ -O-Methyltransferase yenye 1μg λ-Hind III huyeyusha DNA ifikapo 37 ℃ kwa saa 16 haitoi uharibifu wowote kama inavyobainishwa na elektrophoresis ya gel ya agarose.

Endonuclease: 50 U ya mRNA Sura ya 2 ´ -O-Methyltransferase yenye 1 μg λDNA katika 37℃ kwa saa 16 haitoi uharibifu kama inavyobainishwa na electrophoresis ya gel ya agarose.

Nickase: 50U ya mRNA Sura ya 2 ´ -O-Methyltransferase yenye 1μg pBR322 saa 37 ℃ kwa saa 16 haitoi uharibifu kama inavyobainishwa na elektrophoresis ya jeli ya agarose.

RNase: 50U ya mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase yenye 1.6μg MS2 RNA kwa saa 4 katika 37℃ haitoi uharibifu kama inavyobainishwa na electrophoresis ya gel ya agarose.

E. coli DNA: 50U ya mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase inachunguzwa kwa uwepo waE. coli DNA ya genomic kwa kutumia TaqMan qPCR iliyo na vianzio maalum kwa ajili yaE. coli 16S rRNA eneo.TheE. coli Uchafuzi wa DNA ya genomic ni =1E. coli jenomu.

Bakteria Endotoxin: Jaribio la LAL, kulingana na toleo la Kichina la Pharmacopoeia IV 2020, njia ya mtihani wa kikomo cha gel, kanuni ya jumla (1143).Maudhui ya endotoxin ya bakteria yanapaswa kuwa =10 EU/mg.

Mfumo wa majibu na masharti

1. Changanya kiasi kinachofaa cha Capped RNA na H2O isiyo na RNase katika mirija ya mikrofuge ya mililita 1.5 hadi ujazo wa mwisho wa 16.0 µL.

2. Joto kwa 65℃ kwa dakika 5 ikifuatiwa na kuoga kwa barafu kwa dakika 5.

3. Ongeza vipengele vifuatavyo kwa mpangilio uliobainishwa (kwa methylation ya Capped RNA

chini ya 10

*10× Kipengele cha Kuzuia Menyuko : 500 mm Tris-HCl(pH 8.0, 25℃), 50 mm KCl, 10 mm MgCl2 、 10 mm DTT.

4. Ingiza kwa 37℃ kwa saa 1 (saa 2 za incubation inapendekezwa kwa kipande kinacholengwa chini ya nt 200).

Maombi

Ili kuboresha mwonekano wa mRNA wakati wa majaribio ya kudunga kidogo na uhamishaji.

Vidokezo vya matumizi

1. Kabla ya majibu, RNA inapaswa kusafishwa na kufutwa katika maji yasiyo na nuclease, ufumbuzi wote haupaswi kuwa na EDTA na ions yoyote.

2. Inapendekezwa kuwasha sampuli ya RNA kwa joto la 65℃ kwa dakika 5 kabla ya majibu ili kuondoa muundo wa pili kwenye 5'mwisho wa nakala.Inaweza kupanuliwa hadi dakika 10 kwa muundo changamano wa 5 ´ -terminal.