M-MLV Reverse Transcriptase
RevScript Reverse transcriptase hupatikana kwa teknolojia ya uhandisi jeni.Ina uwezo wa juu wa usanisi wa cDNA, uthabiti wa joto na kikomo cha joto cha mmenyuko (hadi 60 ° C).Bidhaa ya cDNA iliyosanisishwa ni hadi kb 10.Huongeza mshikamano wa violezo na inafaa kwa unukuzi wa kinyume cha violezo vya RNA vyenye muundo tata wa pili au jeni zenye nakala ndogo.
Vipengele
| Sehemu | HC2003B (U10,000) | HC2003B (5*10,000U) | HC2003B (U200,000) |
| RevScript Reverse Transcriptase (200U/μL) | 50 μL | 5×50 μL | 1 ml |
| 5 × RevScript Buffer | 250 μL | 1.25 ml | 5 ml |
Hali ya Uhifadhi
Bidhaa hii inapaswa kuhifadhiwa kwa -25°C~-15°C kwa miaka 2.
Ufafanuzi wa Kitengo
Kizio kimoja hujumuisha nmol 1 ya dTTP katika nyenzo isiyoweza kuyeyuka kwa asidi katika dakika 10 kwa 37°C kwa kutumia Oligo(dT) kama vianzilishi.
Usanidi wa Majibu
1.Ubadilishaji wa kiolezo cha RNA (Hatua hii ni ya hiari, urekebishaji wa kiolezo cha RNA husaidia kufungua miundo ya pili, ambayo itaboresha mavuno ya cDNA ya uzi wa kwanza.)
| Vipengele | Kiasi (μL) |
| RNase ddH ya bure2O | Hadi 13 |
| Oligo(dT)18 (50 μmol/L) au Primer Nasibu (50 μmol/L) Au Viingilio Maalum vya Jeni (2 μmol/L) | 1 |
| au 1 | |
| au 1 | |
| Kiolezo cha RNA | X a |
Vidokezo:
1) a: Jumla ya RNA: 1-5 ug au mRNA: 1-500 ng
2) Kuachilia kwa 65°C kwa dakika 5, kisha weka kwenye barafu mara moja ili kubaridi kwa dakika 2.Uwekaji katikati kwa kifupi ili kukusanya kioevu cha mmenyuko, ongeza suluhu ya majibu ya unukuzi kinyume kama inavyoonyeshwa kwenye jedwali lifuatalo.Upole pipette kuchanganya.
1.Maandalizi ya mchanganyiko wa mmenyuko (kiasi cha 20 μL)
| Vipengele | Kiasi (μL) |
| Mchanganyiko wa hatua ya awali | 13 |
| 5×Bafa | 4 |
| Mchanganyiko wa dNTP (10nmol/L) | 1 |
| Nakala ya Nyuma (200 U/μL) | 1 |
| Kizuizi cha RNase (40 U/μL) | 1 |
1.Fanya majibu chini ya masharti yafuatayo:
| Halijoto (°C) | Wakati |
| 25 °Ca | Dakika 5 |
| 42 °Cb | Dakika 15-30 |
| 85 °Cc | Dakika 5 |
Vidokezo:
1) a.Kualika kwa 25°C kwa dakika 5 inahitajika tu kwa kutumia hexamers nasibu.Tafadhali ruka hatua hii unapotumia Oligo (dT)18au Gene Specific Primer.
2) b.Halijoto ya unukuzi wa kinyume inayopendekezwa ni 42°C, kwa violezo vilivyo na miundo ya upili changamano au maudhui ya juu ya GC, inashauriwa kuongeza halijoto ya mmenyuko hadi 50-55°C.
3) c.Inapasha joto kwa 85°C kwa dakika 5 ili kuzima nakala ya reverse.
4) Bidhaa inaweza kutumika moja kwa moja katika athari za PCR au qPCR, au kuhifadhiwa kwa -20°C kwa hifadhi ya muda mfupi.Inashauriwa kuunganisha bidhaa na kuhifadhi kwa -80 ° C kwa uhifadhi wa muda mrefu.Epuka kufungia mara kwa mara.
5) Bidhaa inafaa kwa RT-qPCR ya hatua moja, inashauriwa kuongeza 10-20 U reverse transcriptase kwa kila mfumo wa mmenyuko wa 25μL, au kuongeza hatua kwa hatua kiasi cha reverse transcriptase kulingana na hali halisi.
Vidokezo
1.Tafadhali weka eneo la majaribio katika hali ya usafi;Glavu na masks safi zinapaswa kuvikwa wakati wa operesheni.Vifaa vyote vya matumizi vilivyotumika katika jaribio vinapaswa kuwa bila RNase ili kuzuia uchafuzi wa RNase.
2.Taratibu zote zinapaswa kufanywa kwenye barafu ili kuzuia uharibifu wa RNA.
3.Sampuli za ubora wa juu za RNA zinapendekezwa ili kuhakikisha ufanisi wa juu wa unukuzi wa kinyume.
4.Bidhaa hii ni kwa matumizi ya utafiti tu.
5.Tafadhali fanya kazi na makoti ya maabara na glavu zinazoweza kutumika kwa usalama wako.
