RNA yenye nyuzi mbili (dsRNA) ELISA KIT

Seti hii ni Kipimo cha Kingamwili kilichounganishwa na Enzyme-Linked (ELISA) kilichounganishwa na mfumo wa biotin-Streptavidin, kwa kipimo cha kiasi cha dsRNA yenye urefu wa zaidi ya jozi 60 za msingi(bp), bila kujali mfuatano.Sahani imepakwa awali na kingamwili ya anti-dsRNA.dsRNA iliyopo kwenye sampuli huongezwa na kuunganishwa na kingamwili zilizopakwa kwenye visima.Na kisha kingamwili ya anti-dsRNA ya biotini huongezwa na kuunganishwa kwa dsRNA katika sampuli.Baada ya kuoshwa, HRP-Streptavidin huongezwa na kuunganishwa na kingamwili ya anti-dsRNA ya Biotinylated.Baada ya incubation kufunguliwa, HRP-Streptavidin huoshwa na maji.Kisha myeyusho wa substrate ya TMB huongezwa na kuchochewa na HRP ili kutoa bidhaa ya rangi ya buluu iliyobadilika kuwa ya manjano baada ya kuongeza suluji ya tindikali.Msongamano wa manjano unalingana na kiwango kinacholengwa cha dsRNA kilichonaswa kwenye sahani.Kunyonya hupimwa kwa 450 nm.

Maombi

Seti hii ni ya kipimo cha kiasi cha mabaki ya dsRNA.

Vipengele vya kit

Uhifadhi na Utulivu

1. Kwa seti ambayo haijatumika: Seti nzima inaweza kuhifadhiwa kwa 2 ~ 8℃ katika maisha ya rafu.Mwanga mkali unapaswa kuepukwa kwa utulivu wa kuhifadhi.

2. Kwa kifurushi kilichotumika: Pindi microplate inapofunguliwa, tafadhali funika visima ambavyo havijatumika kwa kizuia sahani na urudishe kwenye mfuko wa karatasi ulio na kifurushi cha desiccant, funga mfuko wa karatasi na urudishe hadi 2~8℃ haraka iwezekanavyo baada ya kutumia.Vitendanishi vingine vinapaswa kurejeshwa hadi 2~8℃ haraka iwezekanavyo baada ya matumizi.

Nyenzo Zinazohitajika Lakini Hazijatolewa

1. Kisomaji cha microplate chenye kichujio cha 450±10nm (bora zaidi ikiwa kinaweza kutambua kwa urefu wa 450 na 650 nm).

2. Microplate shaker.

3. Vidokezo vya bure vya RNase na zilizopo za centrifuge.

Operesheni mtiririko wa chati

Kabla Hujaanza

1. Lete vifaa na sampuli zote kwenye joto la kawaida (18-25℃) kabla ya matumizi.Iwapo kifurushi hakitatumika kwa wakati mmoja, tafadhali chukua vipande na vitendanishi kwa ajili ya majaribio ya sasa, na uache vipande na vitendanishi vilivyobaki katika hali inayohitajika.

2. Bafa ya kunawa: punguza 40mL ya 20× bafa ya kunawa iliyokolea kwa 760mL ya maji yaliyotolewa au kuyeyushwa ili kuandaa 800mL ya 1× bafa ya kuosha.

3. Kawaida: zungusha kwa ufupi au weka katikati suluhisho la hisa kabla ya kutumia.Mkusanyiko wa viwango vinne vilivyotolewa ni 5ng/μL.Kwa viwango vya UTP na pUTP dsRNA, tafadhali punguza suluhisho la hisa hadi 1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312,0.0156,0pg/μL ukitumia bafa ya STE ili kuchora mduara wa kawaida.Kwa viwango vya N1-Me-pUTP dsRNA, tafadhali punguza suluhisho la hisa hadi 2,1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312, 0pg/μL ukitumia bafa ya STE ili kuchora mduara wa kawaida.Kwa kiwango cha 5-OMe-UTP dsRNA, tafadhali punguza suluhisho la hisa hadi 4,2,1,0.5, 0.25,0.125,0.0625, 0pg/μL ukitumia bafa ya STE ili kuchora mduara wa kawaida.Tunapendekeza viwango vinaweza kupunguzwa kama chati zifuatazo:

4. Kingamwili ya kugundua biotini na suluhisho la kufanya kazi la HRP-streptavidin: zungusha kwa ufupi au weka katikati suluhisho la hisa kabla ya matumizi.Wapunguze kwa mkusanyiko wa kufanya kazi na bafa ya dilution.

5. Hali ndogo ya TMB: tamani kipimo kinachohitajika cha myeyusho kwa vidokezo vilivyozaa na usitupe myeyusho uliobaki kwenye bakuli tena.Hali ndogo ya TMB ni nyeti kwa mwanga, usiweke mwangaza wa substrate ya TMB kwa muda mrefu.

Kwa kutumia itifaki

1. Amua idadi ya vipande vinavyohitajika kwa uchanganuzi.Ingiza vipande kwenye fremu kwa matumizi.Vipande vya sahani vilivyosalia ambavyo havijatumika katika jaribio hili vinapaswa kupakiwa tena kwenye begi kwa kutumia desiccant.Funga begi kwa ukali kwa kuhifadhi kwenye jokofu.

2. Ongeza 100μL kila moja ya dilutions za kawaida, tupu na sampuli kwenye visima vinavyofaa.Funika na sealer ya sahani.Ingiza kwa saa 1 kwa joto la kawaida na kutikisa kwa 500rpm.Sampuli zinapaswa kuongezwa kwa bafa ya STE hadi mkusanyiko ufaao kwa uchanganuzi sahihi.

3. Hatua ya kunawa: Pakia myeyusho na osha kwa bafa ya safisha ya 250μL kwa kila kisima na uiruhusu isimame kwa 30s.Tupa bafa ya kuosha kabisa kwa kupiga sahani kwenye karatasi ya kunyonya.Osha kabisa mara 4.

4. Ongeza 100μL ya suluhu inayofanya kazi ya kugundua kingamwili ya biotini kwenye kila kisima.Funika na sealer ya sahani.Ingiza kwa saa 1 kwa joto la kawaida na kutikisa kwa 500rpm.

5. Rudia hatua ya safisha.

6. Ongeza 100μL ya suluhisho la kufanya kazi la HRP-streptavidin kwenye kila kisima.Funika na sealer ya sahani.Ingiza kwa dakika 30 kwa joto la kawaida na kutetemeka kwa 500rpm.

7. Rudia hatua ya safisha tena.

8. Ongeza 100μL ya myeyusho wa substrate ya TMB kwenye kila kisima.Funika na sealer ya sahani.Ingiza kwa dakika 30 kwenye RT Protect kutoka kwa mwanga.Kioevu kitageuka bluu kwa kuongeza suluhisho la substrate.

9. Ongeza 50μL ya suluhisho la kuacha kwenye kila kisima.Kioevu kitageuka njano kwa kuongeza ufumbuzi wa kuacha.Kisha endesha kisoma microplate na upime kipimo kwa 450nm mara moja.

Uhesabuji wa Matokeo

1. Kadiria usomaji unaorudiwa kwa kila kiwango, udhibiti na sampuli na uondoe wastani wa msongamano wa kawaida wa sifuri wa macho.Unda mkunjo wa kawaida wenye kunyonya kwenye mhimili wima(Y) na mkusanyiko wa dsRNA kwenye mhimili mlalo(X).

2. Inapendekezwa kuhesabu kwa kutumia programu inayolingana na curve inayolingana na kompyuta kama vile mtaalamu wa curve 1.3 au ELISA Calc katika kielelezo cha 5 au 4 kisicholingana na mstari.

Utendaji

1. Unyeti:

kikomo cha chini cha utambuzi: ≤ 0.001pg/μL (kwa UTP-, pUTP-, N1-Me-pUTP-dsRNA), ≤ 0.01pg/μL (kwa 5-OMe-UTP-dsRNA).

kikomo cha chini cha kiasi:0.0156 pg/μL (kwa UTP-, pUTP-dsRNA),0.0312 pg/μL (kwa N1-Me-pUTP-dsRNA),0.0625 pg/μL (kwa 5-OMe-UTP-dsRNA).

2. Usahihi: CV ya Uchunguzi wa Ndani ≤10%, CV ya Inter-Assay ≤10%

3. Urejeshaji:80%~120%

4.Linearity:0.0156-0.5pg/μL(forUTP-,pUTP-dsRNA)0.0312-1pg/μL(forN1-Me-pUTP dsRNA),0.0625-1pg/μL(kwa 5-OMe-UTP-dsRNA).

Mazingatio

1. Halijoto ya majibu ya TMB na wakati ni muhimu, tafadhali zidhibiti kulingana na maagizo kwa uangalifu.

2. Ili kufikia reproducibility nzuri ya assay na unyeti, kuosha sahihi ya sahani ili kuondoa reagents zisizo na majibu ni muhimu.

3. Vitendanishi vyote vinapaswa kuchanganywa vizuri kabla ya kuvitumia na kuepuka bumbles wakati wa sampuli au kuongeza vitendanishi.

4. Ikiwa fuwele zimeundwa kwenye bafa ya kuosha iliyokolea(20x), joto hadi 37℃ na changanya kwa upole hadi fuwele ziyeyuke kabisa.

5. Epuka majaribio ya sampuli zilizo na Sodiamu Azide (NaN3), kwa kuwa inaweza kuharibu shughuli za HRP na kusababisha kukadiria chini ya kiwango cha dsRNA.

6. Epuka uchafuzi wa RNase wakati wa majaribio.

7. Sampuli ya kawaida/sampuli, kingamwili ya kutambua na SA-HRP pia inaweza kufanywa kwenye RT bila kutikisika, lakini hii inaweza kusababisha unyeti wa utambuzi kupungua mara moja.Katika kesi hii, tunapendekeza viwango vya UTP na pUTP dsRNA vipunguzwe kutoka 2pg/μL, viwango vya N1-Me-pUTP dsRNA vinapaswa kupunguzwa kutoka 4pg/μL na 5-OMe-UTP dsRNA kiwango lazima diluted kutoka 8pg/μL.Kwa kuongeza, weka suluhisho la kufanya kazi la HRP-streptavidin kwa dakika 60 kwenye joto la kawaida.Usitumie shaker ya chupa, kwa sababu shaker ya chupa inaweza kusababisha matokeo yasiyofaa.

Matokeo ya kawaida

1. Data ya kawaida ya curve

2. Hesabu ya kawaida ya curve

3. Aina ya ugunduzi wa mjengo: 0.0312- 1pg/μL